ПТР (MSP) метилжүүлэлтийн иж бүрдэл

A-1 загвар

■ Загвар нь уургийн хольц эсвэл Taq дарангуйлагч гэх мэтийг агуулдаг - ДНХ -ийн загварыг цэвэрлэж, уургийн хольцыг арилгаж эсвэл ДНХ -ийн загварыг цэвэршүүлэх хэрэгслээр гаргаж авна.

■ Загварын денатура нь дуусаагүй байна - —Денатурацийн температурыг зохих ёсоор нэмэгдүүлж, денатурацийн хугацааг уртасгана.

■ Загварын доройтол —- Загварыг дахин бэлдэх.

А-2 праймер

■ Праймерын чанар муу —— Праймерыг дахин нийлэгжүүлнэ.

■ Праймерын доройтол - Хадгалалт хийхийн тулд өндөр концентрацитай праймерыг бага хэмжээгээр хуваана. Олон удаа хөлдөх, гэсэхээс зайлсхийх, эсвэл 4 ° C-ийн температурт удаан хадгалах.

■ Праймерын зохисгүй дизайн (жишээлбэл, праймерын урт хангалтгүй, праймерын хооронд бүдгэрүүлэгч бий болсон гэх мэт) -Дахин дизайн хийх праймер (праймер болон хоёрдогч бүтэц үүсэхээс зайлсхийх)

А-3 мг²⁺төвлөрөл

■ Мг²⁺ концентраци хэт бага - Мг -ийг тогтмол нэмэгдүүлэх²⁺ концентраци: Mg -ийг оновчтой болгох²⁺ оновчтой Mg -ийг тодорхойлохын тулд 0.5мМ -ийн интервалтай 1мМ -ээс 3мМ хүртэлх урвалын цувралаар концентраци²⁺ загвар ба праймер бүрийн концентраци.

A-4 Шатаах температур

■ Өндөр халаах температур нь праймер ба загварыг холбоход нөлөөлдөг. —- Зуурах температурыг бууруулж, нөхцлийг 2 ° C градиентээр оновчтой болгоно.

A-5 Сунгах хугацаа

■ Богино сунгалтын хугацаа —— Сунгах хугацааг нэмэгдүүлэх.

Үзэгдэл: Сөрөг дээжүүд нь зорилтот дарааллын зурвасуудыг харуулдаг.

А-1 ПГУ-ын бохирдол

■ Зорилтот дараалал эсвэл олшруулах бүтээгдэхүүний хөндлөн бохирдол - Зорилтот дарааллыг агуулсан дээжийг сөрөг дээжинд пипеткээр оруулахгүй байх, эсвэл центрифугийн хоолойноос асгахгүй байх. Одоо байгаа нуклейн хүчлийг устгахын тулд урвалж буюу тоног төхөөрөмжийг автоклавт хийж, сөрөг нөлөөллийн туршилтаар бохирдол байгаа эсэхийг тодорхойлох шаардлагатай.

■ Урвалжийн бохирдол - Урвалжуудыг олшруулж, бага температурт хадгална.

A-2 Primer

■ Мг²⁺ концентраци хэт бага - Мг -ийг тогтмол нэмэгдүүлэх²⁺ концентраци: Mg -ийг оновчтой болгох²⁺ оновчтой Mg -ийг тодорхойлохын тулд 0.5мМ -ийн интервалтай 1мМ -ээс 3мМ хүртэлх урвалын цувралаар концентраци²⁺ загвар ба праймер бүрийн концентраци.

■ Праймерын зохисгүй дизайн, зорилтот дараалал нь зорилтот бус дараалалтай ижил төстэй шинж чанартай байдаг. —- Дахин дизайн хийх праймер.

Үзэгдлүүд: ПГУ-ын олшруулалтын зурвас нь хүлээгдэж буй хэмжээтэй нийцэхгүй байна, том эсвэл жижиг, эсвэл заримдаа тусгай өсгөлтийн болон өвөрмөц бус өсгөлтийн зурвас хоёулаа тохиолддог.

A-1 праймер

■ Праймерын өвөрмөц чанар муу

—- Дахин дизайн хийх праймер.

■ Праймерын концентраци хэт өндөр - денатурацийн температурыг зохих ёсоор нэмэгдүүлж, денатурацийн хугацааг уртасгадаг.

А-2 мг²⁺ төвлөрөл

■ Мг²⁺ концентраци хэт өндөр —— Mg2+ концентрацийг зохих ёсоор бууруулна: Mg -ийг оновчтой болгоно²⁺ оновчтой Mg -ийг тодорхойлохын тулд 0.5мМ -ийн интервалтай 1мМ -ээс 3мМ хүртэлх урвалын цувралаар концентраци²⁺ загвар ба праймер бүрийн концентраци.

А-3 Дулаан тэсвэртэй полимераза

■ Ферментийн хэт их хэмжээ - ферментийн хэмжээг 0.5 U интервалтайгаар зохих хэмжээгээр бууруулна.

A-4 Шатаах температур

■ Нэвчилтийн температур хэт бага байна.

А-5 ПГУ-ын мөчлөг

■ ПГУ -ын хэт олон мөчлөг - ПГУ -ын мөчлөгийн тоог багасгах.

A-1 праймер—— Муу чанар-Праймерын загварыг дахин боловсруулж, өвөрмөц байдлыг нь сайжруулахын тулд праймерын байрлал, уртыг өөрчлөх; эсвэл үүрлэсэн ПГУ хийх.

А-2 загвар ДНХ

—– Загвар нь цэвэр биш - Загварыг цэвэрлэж эсвэл ДНХ -ийг цэвэрлэх хэрэгслээр гаргаж авна.

А-3 мг²⁺ төвлөрөл

—-Мг²⁺ концентраци хэт өндөр - Мг -ийг тогтмол бууруулдаг²⁺ концентраци: Mg -ийг оновчтой болгох²⁺ оновчтой Mg -ийг тодорхойлохын тулд 0.5мМ -ийн интервалтай 1мМ -ээс 3мМ хүртэлх урвалын цувралаар концентраци²⁺ загвар ба праймер бүрийн концентраци.

A-4 dNTP

—DNTP -ийн концентраци хэт өндөр байна - dNTP -ийн концентрацийг зохих ёсоор бууруулна

A-5 Шатаах температур

—- Зуухлах температур маш бага ——Нухах температурыг зохих ёсоор нэмэгдүүлэх

А-6 мөчлөг

——Хэт олон мөчлөг ——Циклийн тоог оновчтой болгох

Эхний алхам бол тохиромжтой полимеразыг сонгох явдал юм. Тогтмол Taq полимераз нь 3'-5 'экзонуклеазын идэвх дутагдсаны улмаас шалгаж унших боломжгүй бөгөөд үл нийцэх байдал нь фрагментийн суналтын үр ашгийг ихээхэн бууруулдаг. Тиймээс ердийн Taq полимераз нь 5 кб -аас том хэмжээтэй зорилтот хэсгүүдийг үр дүнтэй өсгөж чадахгүй. Өргөтгөлийн үр ашгийг дээшлүүлэх, урт фрагментийг олшруулах хэрэгцээг хангахын тулд тусгай өөрчлөлттэй эсвэл өөр өндөр чанартай полимераз бүхий так полимеразыг сонгох шаардлагатай. Нэмж дурдахад урт фрагментийг олшруулахын тулд праймерын дизайн, денатурацийн хугацаа, сунгах хугацаа, буфер рН гэх мэтийг тохируулах шаардлагатай байдаг. Ихэвчлэн 18-24 даралттай праймер нь илүү сайн ургац авахад хүргэдэг. Загварын эвдрэлээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд 94 ° C температурт денатурацийн хугацааг нэг мөчлөгт 30 секунд буюу түүнээс бага болгож, олшруулахаас өмнө температурыг 94 ° C хүртэл нэмэгдүүлэх хугацааг 1 минутаас бага байх ёстой. Түүгээр ч үл барам температурыг ойролцоогоор 68 0С -т тохируулж, сунгах хугацааг 1 кб/мин -ийн хурдаар төлөвлөх нь урт хэсгүүдийг үр дүнтэй олшруулах боломжийг олгодог.

ПГУ -ын олшруулалтын алдааны түвшинг өндөр нарийвчлалтай янз бүрийн ДНХ полимеразын тусламжтайгаар бууруулж болно. Одоогоор олсон бүх Taq DNA полимеразуудын дотроос Pfu фермент хамгийн бага алдааны түвшинтэй, хамгийн өндөр үнэнч байдаг (хавсаргасан хүснэгтийг үзнэ үү). Ферментийн сонголтоос гадна судлаачид урвалын нөхцлийг оновчтой болгох замаар ПГУ -ын мутацийн түвшинг бууруулах боломжтой бөгөөд үүнд буферийн найрлага, термостабол полимеразын концентраци, ПГУ -ын мөчлөгийн тоог оновчтой болгох зэрэг орно.