TIANSeq RNA-Seq багц (гэрэлтүүлэг)

Одоогийн байдлаар өндөр дамжуулах чадвартай дарааллын технологи нь ихэвчлэн дараагийн үеийн дарааллын технологид суурилдаг. Дараагийн үеийн дарааллын технологийн унших урт хязгаарлагдмал тул бид бүтэн уртын дарааллыг жижиг фрагментийн номын сан болгон хуваах ёстой. Янз бүрийн дараалсан туршилтуудын хэрэгцээ шаардлагын дагуу бид ихэвчлэн нэг төгсгөлтэй дараалал эсвэл хоёр төгсгөлтэй дарааллыг сонгодог. Одоогийн байдлаар дараагийн үеийн дараалсан номын сангийн ДНХ хэсгүүдийг ерөнхийдөө 200-800 bp-ийн хүрээнд тарааж байна.

a) ДНХ нь чанар муутай, дарангуйлагч агуулдаг. Ферментийн идэвхийг дарангуйлахгүйн тулд өндөр чанартай ДНХ дээж ашиглана уу.

б) ДНХ-ийн номын сан барихад ПГУ-гүй аргыг ашиглахад ДНХ-ийн дээжийн хэмжээ хангалтгүй байна. Хэсэгчилсэн ДНХ-ийн оролт 50 нг-ээс хэтэрсэн тохиолдолд номын сан байгуулах явцад ПГУ-гүй ажлын урсгалыг сонгон гүйцэтгэж болно. Хэрэв номын сангийн хуулбарлах тоо хэт бага байвал шууд дараалалд оруулах боломжгүй бол адаптерийг холбосны дараа ДНХ -ийн номын санг ПГУ -аар олшруулж болно.

в) РНХ -ийн бохирдол нь ДНХ -ийн анхны тоон тодорхой бус байдлыг үүсгэдэг Геномын ДНХ -ийг цэвэршүүлэх явцад РНХ -ийн бохирдол үүсч болох бөгөөд энэ нь номын сангийн барилгын явцад ДНХ -ийн тоо хэмжээ буруу, ДНХ -ийн ачаалал хангалтгүй байдалд хүргэж болзошгүй юм. RNA -ийг эмчлэх замаар РНХ -ийг устгаж болно.

А-1

a) Жижиг фрагментууд (60 bp-120 bp) гарч ирнэ Жижиг фрагментууд нь ихэвчлэн адаптеруудын үүсгэсэн адаптерийн хэсгүүд эсвэл димерүүд юм. Agencourt AMPure XP соронзон бөмбөлгүүдийг ашиглан цэвэршүүлэх нь эдгээр адаптерийн хэсгүүдийг үр дүнтэй арилгаж, дарааллын чанарыг баталгаажуулдаг.

б) ПГУ -ыг олшруулсны дараа номын санд том хэсгүүд гарч ирнэ Адаптерийг холбосны дараа номын сангийн ДНХ -ийн фрагментийн хэмжээ 120 bp -ээр нэмэгдэх болно. Хэрэв адаптерийг холбосны дараа ДНХ -ийн фрагмент 120 bp -ээс их нэмэгдвэл энэ нь ПГУ -ын хэт олшруулалтын хэвийн бус фрагментийн олшролттой холбоотой байж болох юм. ПГУ -ын мөчлөгийн тоог багасгах нь нөхцөл байдлаас урьдчилан сэргийлэх боломжтой юм.

в) Адаптерийг холбосны дараа номын сангийн ДНХ -ийн хэлтэрхийнүүдийн хэвийн бус хэмжээ Энэхүү иж бүрдэл дэх адаптерийн урт нь 60 bp байна. Хэсгийн хоёр үзүүрийг адаптертай холбосон тохиолдолд урт нь зөвхөн 120 цохилтоор нэмэгдэх болно. Энэхүү иж бүрдэлээс өөр адаптер ашиглахдаа адаптерийн урт гэх мэт холбогдох мэдээллийг нийлүүлэгчтэй холбоо барина уу. Туршилтын ажлын явц, үйл ажиллагаа нь гарын авлагад заасан алхмуудыг дагаж байгаа эсэхийг шалгаарай.

d) Адаптерийг холбохоос өмнө ДНХ -ийн фрагментийн хэвийн бус хэмжээ Энэ асуудлын шалтгаан нь ДНХ -ийн хуваагдлын үед урвалын буруу нөхцлөөс үүдэлтэй байж болно. ДНХ -ийн өөр оролтонд өөр өөр урвалын хугацааг ашиглах ёстой. Хэрэв ДНХ-ийн оролт 10 нг-ээс их байвал 12 минутын урвалын хугацааг оновчтой болгох хугацааг сонгохыг зөвлөж байна, энэ үед үйлдвэрлэсэн фрагментийн хэмжээ нь ихэвчлэн 300-500 bp-ийн хүрээнд байна. Хэрэглэгчид ДНХ-ийн хэсгүүдийг шаардлагатай хэмжээгээр оновчтой болгохын тулд өөрийн шаардлагын дагуу ДНХ-ийн хэсгүүдийн уртыг 2-4 минутын турш нэмэгдүүлэх эсвэл бууруулах боломжтой.

А-2

а) Хэсэглэх хугацааг оновчтой болгоогүй бол хэрчсэн ДНХ хэт жижиг эсвэл хэт том байвал урвалын хугацааг тодорхойлохын тулд зааварт заасан хуваагдах хугацааг сонгох удирдамжийг үзнэ үү. хуваагдах хугацааг илүү нарийвчлалтай тохируулахын тулд 3 минут уртасгах эсвэл богиносгох урвалын систем.

А-3

Хэсэгчилсэн эмчилгээ хийсний дараа ДНХ -ийн хэмжээ хэвийн бус тархалт

а) Урвалжийг задлах буруу гэсгээх арга, эсвэл гэсгээсэний дараа урвалж бүрэн холилддоггүй. 5 × Fragmentation Enzyme Mix урвалжийг мөсөн дээр гэсгээнэ. Гэсгээсэний дараа урвалжийг жигд хольж, хоолойны ёроолыг зөөлөн дарна. Урвалжийг бүү эргүүлээрэй!

б) ДНХ -ийн оролтын дээж нь EDTA эсвэл бусад бохирдуулагч бодис агуулдаг Давсны ионууд болон хелатжуулагч бодисуудыг устгах нь ДНХ -ийг цэвэршүүлэх үе шатанд туршилтын амжилтанд онцгой ач холбогдолтой юм. Хэрэв ДНХ -ийг 1 × TE -д уусгасан бол фрагмент хийх зааварт заасан аргыг ашиглана уу. Хэрэв уусмал дахь EDTA -ийн концентраци тодорхойгүй байвал ДНХ -ийг цэвэршүүлж, ионгүйжүүлсэн усанд уусган дараагийн хариу үйлдлийг хийхийг зөвлөж байна.

в) ДНХ -ийн анхны тоо хэмжээ буруу байна Хэсэгчилсэн ДНХ -ийн хэмжээ нь ДНХ -ийн оролтын хэмжээтэй нягт холбоотой. Хэсэгчилсэн эмчилгээ хийхээс өмнө урвалын систем дэх ДНХ -ийн хэмжээг нарийн тодорхойлохын тулд Qubit, Picogreen болон бусад аргыг ашиглан ДНХ -ийн үнэн зөв тоог гаргах нь чухал юм.

 d) Урвалын системийг бэлтгэх зааварчилгааг дагаж мөрддөггүй. Хуваасан урвалын системийг бэлтгэх ажлыг зааврын дагуу хатуу мөсөн дээр хийх ёстой. Хамгийн сайн үр дүнд хүрэхийн тулд бүх урвалын бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг мөсөн дээр байрлуулж, бүрэн хөргөсний дараа урвалын системийг бэлтгэх ажлыг хийх ёстой. Бэлтгэл ажил дууссаны дараа сайтар холино. Битгий эргүүлээрэй!

1. Буруу холих арга (эргүүлэг, хүчирхийллийн хэлбэлзэл гэх мэт) нь номын сангийн хэлтэрхийнүүдийн хэвийн бус хуваарилалтыг үүсгэж (дараах зурагт үзүүлсэн шиг) номын сангийн чанарт нөлөөлнө. Тиймээс, Fragmentation Mix -ийн урвалын уусмалыг бэлдэхдээ хуруугаараа хуруугаараа хуруугаараа хуруугаараа хуруугаараа хуруугаараа хольж хутгана. Хуйлтай холилдохоос болгоомжил.

2. Номын сангийн барилгын ажилд өндөр цэвэр ДНХ ашиглах ёстой

■ ДНХ -ийн бүрэн бүтэн байдал: Электрофорезийн хамтлаг нь 30 кб -аас их, сүүлгүй

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. ДНХ -ийн оролтын хэмжээ үнэн зөв байх ёстой ДНХ -ийг тодорхойлохдоо нанодроп биш харин Qubit болон PicoGreen аргыг ашиглахыг зөвлөж байна.

4. ДНХ -ийн уусмал дахь EDTA -ийн агуулгыг тодорхойлох ёстой. EDTA нь хуваагдах урвалд маш их нөлөөтэй. Хэрэв EDTA -ийн агууламж өндөр байвал дараагийн шинжилгээний өмнө ДНХ -ийн цэвэрлэгээ хийх шаардлагатай.

5. Хэсэгчилсэн урвалын уусмалыг мөсөн дээр бэлтгэсэн байх ёстой. Хагалах процесс нь урвалын температур, цаг хугацааг (ялангуяа сайжруулагч нэмсний дараа) мэдрэмтгий байдаг. Урвалын цаг хугацааны нарийвчлалыг хангахын тулд урвалын системийг мөсөн дээр бэлдээрэй.

6. Хэсэгчилсэн урвалын хугацаа үнэн зөв байх ёстой. Хуваах үе шатны урвалын хугацаа нь фрагмент бүтээгдэхүүний хэмжээнд шууд нөлөөлөх тул номын сан дахь ДНХ -ийн хэлтэрхийнүүдийн тархалтын хэмжээнд нөлөөлнө.

1. Энэхүү иж бүрдэлд ямар төрлийн дээж хэрэглэх боломжтой вэ?

Энэхүү иж бүрдэлд хэрэглэх дээжийн төрөл нь сайн РНХ -ийн бүрэн бүтэн байдал бүхий нийт РНХ эсвэл цэвэршүүлсэн мРНХ байж болно. Хэрэв номын санг байгуулахад нийт РНХ ашигладаг бол эхлээд rRNA -ийг устгахын тулд rRNA -ийн хомсдолын иж бүрдлийг (Cat#4992363/4992364/4992391) ашиглахыг зөвлөж байна.

2. FFPE дээжийг энэхүү иж бүрдэл ашиглан номын сан байгуулахад ашиглаж болох уу?

FFPE дээж дэх mRNA нь харьцангуй муу шударга байдалтай тодорхой хэмжээгээр доройтох болно. Номын санг барихад энэхүү иж бүрдлийг ашиглахдаа хуваагдах хугацааг оновчтой болгохыг зөвлөж байна.

3. Бүтээгдэхүүний гарын авлагад заасан хэмжээг сонгох алхамыг ашиглан оруулсан сегмент нь бага зэрэг хазайлт үүсгэхэд юу нөлөөлж болох вэ?

Хэмжээ сонгохдоо энэхүү бүтээгдэхүүний гарын авлагад заасан хэмжээг сонгох алхамыг чанд мөрдөнө. Хэрэв хазайлт байгаа бол шалтгаан нь соронзон бөмбөлгүүдийг өрөөний температурт тэнцвэржүүлээгүй эсвэл бүрэн холилдохгүй, пипеткийг нарийвчлахгүй эсвэл шингэнийг үзүүрт үлдээсэнтэй холбоотой байж болох юм. Туршилтанд бага шингээлттэй зөвлөмжийг ашиглахыг зөвлөж байна.

4. Номын сангийн барилгад адаптер сонгох

Номын сангийн барилгын иж бүрдэлд адаптер урвалж агуулагдаагүй тул энэхүү иж бүрдлийг TIANSeq Single Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) -тэй хамт ашиглахыг зөвлөж байна.

5. Номын сангийн QC

Номын сангийн тоон илрүүлэлт: Qubit ба qPCR нь номын сангийн массын концентраци ба молийн концентрацийг тодорхойлоход хэрэглэгддэг. Үйл ажиллагаа нь бүтээгдэхүүний гарын авлагын дагуу хатуу хийгддэг. Номын сангийн төвлөрөл нь ерөнхийдөө NGS дарааллын шаардлагыг хангана. Номын сангийн тархалтын хүрээг илрүүлэх: Номын сангийн тархалтын хүрээг илрүүлэхийн тулд Agilent 2100 Bioanalyzer програмыг ашиглана.

6. Олшруулах мөчлөгийн дугаарыг сонгох

Зааварт заасны дагуу ПГУ-ын мөчлөгийн тоо 6-12 байх ба шаардлагатай ПГУ-ын мөчлөгийн тоог түүвэрлэлтийн дагуу сонгох ёстой. Өндөр бүтээмжтэй номын сангуудад хэт их олшруулалт ихэвчлэн өөр өөр түвшинд тохиолддог бөгөөд энэ нь Agilent 2100 Bioanalyzer-ийг илрүүлэх зорилтот түвшний оргил эсвэл Qubit-ийн илрүүлсэн концентраци нь qPCR-ээс бага байдаг. Зөөлөн хэт олшрох нь ердийн үзэгдэл бөгөөд номын сангийн дараалал болон дараагийн өгөгдлийн шинжилгээнд нөлөөлдөггүй.

7. Агилт 2100 Биоанализаторын илрүүлэх профайл дээр спикс гарч ирдэг

Agilent 2100 Bioanalyzer илрүүлэлтэнд үзүүрүүд гарч ирэх нь дээжийн жигд бус хуваагдмал байдлаас үүдэлтэй бөгөөд тодорхой хэмжээтэй хэсгүүд илүү их байх болно, энэ нь ПГУ -ыг баяжуулсны дараа илүү тодорхой болно. Энэ тохиолдолд хэмжээтэй сонголт хийхгүй байхыг зөвлөж байна, өөрөөр хэлбэл хуваагдлын нөхцлийг 94 ° С -т 15 минутын турш инкубацийн горимд тохируулахыг зөвлөж байна.