FastKing Нэг алхам RT-ПГУ-ын иж бүрдэл

А-1 РНХ нь задардаг

—- Бохирдолгүй өндөр чанартай РНХ -ийг цэвэршүүлнэ. РНХ -ийг задлахаас урьдчилан сэргийлэхийн тулд РНХ -ийг гаргаж авсан материал нь аль болох шинэлэг байх ёстой. RT урвал үзүүлэхээс өмнө денатурат гель дээр РНХ -ийн бүрэн бүтэн байдалд дүн шинжилгээ хийх. РНХ -ийг олборлосны дараа үүнийг 100% формамид хадгална. Хэрэв RNase дарангуйлагчийг хэрэглэвэл халаалтын температур <45 ° C, рН нь 8.0 -аас бага байх ёстой, эс тэгвээс дарангуйлагч нь бүх холбогдсон RNase -ийг суллана. Нэмж дурдахад RNase дарангуйлагчийг ≥ 0.8 mM DTT агуулсан уусмалд нэмж оруулах шаардлагатай.

А-2 РНХ нь урвуу транскрипцийн урвалыг дарангуйлагч бодис агуулдаг

—— Урвуу транскрипцийн дарангуйлагчид SDS, EDTA, глицерол, натрийн пирофосфат, спермидин, форамид, гуанидины давс гэх мэт орно. Хяналтын РНХ -ийг дээжтэй хольж, ургацыг хяналтын РНХ -ийн урвалтай харьцуулж дарангуйлагч байгаа эсэхийг шалгана. Дарангуйлагчийг арилгахын тулд РНХ -ийн тунадасыг 70% (v/v) этанолоор угаана.

A-3 cDNA-ийн эхний хэлхээг синтезлэхэд ашигладаг праймерыг хангалтгүй халаах

—- Туршилтанд ашигласан праймерын хувьд халаах температур тохиромжтой болохыг тогтооно. Санамсаргүй hexamers -ийн хувьд урвалын температурт хүрэхээс өмнө температурыг 25 ° C -т 10 минутын турш байлгахыг зөвлөж байна. Генийн тусгай праймерын хувьд (GSP) бусад GSP-ийг туршиж үзэх, эсвэл олиго (dT) эсвэл санамсаргүй гексамер руу шилжих.

A-4 Бага хэмжээний эхлэх РНХ

—- РНХ -ийн хэмжээг нэмэгдүүлэх. 50 нг -ээс бага хэмжээтэй РНХ -ийн дээжийн хувьд эхний хэлхээний cDNA синтезд 0.1 мкг -аас 0.5 мкг ацетил BSA -ийг ашиглаж болно.

А-5 Зорилтот дараалал нь шинжилсэн эдэд илэрхийлэгддэггүй.

—— Бусад эдийг туршиж үзээрэй.

ПГУ-ын А-6 урвал амжилтгүй болно

—- Хоёр үе шаттай RT-ПГУ-ын хувьд ПГУ-ын алхам дахь cDNA загвар нь урвалын эзлэхүүний 1/5-ээс хэтрэхгүй байна.

А-1 Праймер ба загварыг өвөрмөц бус аргаар халаах

——3-төгсгөлийн праймерууд нь 2-3 dG эсвэл dC агуулж болохгүй. Эхний хэлхээний синтезд санамсаргүй праймер эсвэл олиго (dT) -ийн оронд генийн өвөрмөц праймерыг ашигла. Эхний хэдэн мөчлөгт илүү өндөр температурт, дараа нь бага дулаацуулах температурыг ашигла. Урвалын өвөрмөц байдлыг сайжруулахын тулд ПГУ-д халуун эхлэлтэй Taq DNA полимеразыг ашиглана уу.

А-2 Генийн өвөрмөц праймеруудын дизайн муу

—— Праймерын загварыг олшруулахтай ижил зарчмыг баримтална уу.

А-3 РНХ геномын ДНХ-ээр бохирдсон

—- РНХ-ийг ПГУ-ын зэрэглэлийн DNase I. -ээр эмчилнэ.

A-4 Праймер dimer үүсгэх

—- 3 -р төгсгөлд нэмэлт дараалалгүй праймер дизайн хийх.

A-5 Хэт өндөр Mg²⁺ төвлөрөл

—- Mg -ийг оновчтой болгох²⁺ загвар ба праймер хослол бүрийн концентраци

А-6 Гадны ДНХ-ээр бохирдсон

—- Аэрозолд тэсвэртэй зөвлөмж, UDG ферментийг ашигла.

А-1 Эхний судалтай бүтээгдэхүүний агуулга хэт өндөр байна

—- Уламжлалт ПГУ -ын урвалын алхам дахь эхний хэлхээний бүтээгдэхүүний хэмжээг багасгах.

А-2 ПГУ-ын урвал дахь хэт өндөр праймерын хэмжээ

—— Праймерын оролтыг багасгах.

А-3 Хэт олон мөчлөг

ПГУ -ын урвалын нөхцлийг оновчтой болгож, ПГУ -ын мөчлөгийн тоог бууруулна.

А-4 Хэт бага халаах температур

—- Өвөрмөц бус эхлүүлэх, сунгахаас сэргийлэхийн тулд халаах температурыг нэмэгдүүлнэ.

A-5 ДНХ-ийн DNase задралаас үүдэлтэй олигонуклеотидын фрагментийг өвөрмөц бус олшруулах — ДНХ-ийн бохирдлоос сэргийлэхийн тулд өндөр чанартай РНХ-ийг гаргаж авах.

RT-ПГУ нь РНХ-ийг cDNA болгон урвуулж, урвуу хуулбарласан cDNA-ийг зорилтот хэсгийг нэмэгдүүлэхийн тулд ПГУ-ын урвалын загвар болгон ашиглах явдал юм. Туршилтын тодорхой нөхцлийн дагуу санамсаргүй праймер, Oligo dT, генийн тусгай праймерыг сонгоно уу. Дээрх бүх праймерыг үсний хавчаар бүтэцгүй богино эукариот эсийн рНХ -д ашиглаж болно.

Санамсаргүй праймер: Үсний хавчаар бүхий урт РНХ, түүнчлэн rRNA, mRNA, tRNA гэх мэт бүх төрлийн РНХ-д тохиромжтой. Тэдгээрийг ихэвчлэн нэг загварыг RT-ПГУ-ын урвалд оруулахад ашигладаг.

Oligo dT: PolyA хаягдалтай РНХ -д тохиромжтой (прокариотик РНХ, эукариот Олиго dT rRNA ба tRNA нь полиА сүүлгүй). Oligo dT нь PolyA сүүлтэй холбогддог тул РНХ-ийн дээжийн чанар өндөр байх шаардлагатай бөгөөд бага хэмжээний доройтол нь cDNA-ийн бүрэн хэмжээний синтезийн хэмжээг ихээхэн бууруулдаг.

Генийн тусгай праймер: Зорилтот дарааллыг мэддэг нөхцөл байдалд тохирсон загварын дараалалд нэмэлт.

Хоёр арга бий:

1. Дотоод лавлах арга: Онолын хувьд cDNA бол янз бүрийн урттай ДНХ -ийн хэсгүүд тул электрофорезийн үр дүн нь т рхэц юм. Хэрэв РНХ -ийн агууламж бага байвал электрофорезд ямар ч бүтээгдэхүүн харагдахгүй боловч энэ нь ПГУ -аар ямар ч бүтээгдэхүүнийг олшруулахгүй гэсэн үг биш юм. Ерөнхийдөө cDNA -ийг илрүүлэхийн тулд дотоод лавлагаа ашиглаж болно. Хэрэв дотоод лавлагаа нь үр дүнтэй бол cDNA -ийн чанарыг үндсэндээ баталгаажуулж болно (цөөн тохиолдолд зорилтот генийн хэлтэрхий хэт урт байвал үл хамаарах зүйлүүд байж болно).

2. Хэрэв энэ загвараар олшруулсан мэдэгдэж буй ген байгаа бол энэ генийн праймераар баталгаажуулж болно. Дотоод лавлагаа олшруулсан нь cDNA -тай ямар ч асуудал байхгүй гэсэн үг биш юм. Дотоод лавлагаа нь cDNA -д элбэг байдаг тул үүнийг өсгөхөд хялбар байдаг. Хэрэв cDNA нь янз бүрийн шалтгаанаар хэсэгчлэн доройтсон бол магадлалын үүднээс авч үзвэл зорилтот ген багатай ПГУ -ын үр дүн ихээхэн нөлөөлнө. Дотоод лавлагаа маш их хэвээр байгаа ч олшруулалтад нөлөөлөхгүй байх.

РНХ -ийн хэсэгчилсэн задрал. РНХ -ийн бүрэн бүтэн байдлыг илрүүлж цэвэршүүлнэ

Төрөл бүрийн зүйлийн РНХ -ийн агууламж өөр байж болно, гэхдээ ерөнхийдөө олборлосон нийт РНХ нь гель электрофорезын хувьд 28S ба 18S гэсэн хоёр тунгалаг хамтлаг агуулсан байх ёстой бөгөөд өмнөх зурвасын гэрэл нь сүүлийнхээс хоёр дахин өндөр байх ёстой. 5S хамтлаг нь РНХ -ийн доройтол, түүний гэрэл нь доройтлын зэрэгтэй пропорциональ байгааг харуулж байна. Дотоод лавлагаа амжилттай олшруулсан нь РНХ -тэй холбоотой ямар ч асуудал байхгүй гэсэн үг биш юм, учир нь дотоод лавлагаа нь элбэг дэлбэг байдаг тул доройтол нь ноцтой биш бол РНХ -ийг өсгөж болно. OD₂₆₀/OD₂₈₀Спектрофотометрээр хэмждэг цэвэр РНХ -ийн харьцаа 1.9-2.1 хооронд байх ёстой. РНХ дахь бага хэмжээний уургийн хольц нь харьцааг бууруулдаг. Утга хэтэрхий бага биш л бол RT нөлөөлөхгүй. RT -ийн хувьд хамгийн чухал зүйл бол РНХ -ийн бүрэн бүтэн байдал юм.

Дотоод лавлах генийн өргөтгөл нь зөвхөн RT амжилттай болсныг илтгэж болох боловч энэ нь заавал cDNA хэлхээний чанарт хамааралтай биш юм. Дотоод лавлах хэсгүүд нь ерөнхийдөө жижиг хэмжээтэй, илэрхийлэл сайтай байдаг тул урвуу транскрипц хийхэд амжилтанд хүрэх нь илүү хялбар байдаг. Гэсэн хэдий ч зорилтот генийн хэмжээ, илэрхийлэл нь генээс хамаарч өөр өөр байдаг. CDNA чанарыг зөвхөн дотоод лавлагаагаар үнэлэх боломжгүй, ялангуяа 2 кб -аас урт зорилтот хэсгүүдийн хувьд.

Зарим дээж нь хоёрдогч нарийн төвөгтэй бүтэцтэй, эсвэл GC -ийн баялаг агуулгатай, эсвэл элбэг дэлбэгээр үнэ цэнэтэй байдаг. Эдгээр тохиолдолд зорилтот фрагментийн хэмжээ, дээжийн дагуу зохих урвуу транскриптазыг сонгох шаардлагатай. GC -ийн өндөр агуулгатай, хоёрдогч бүтэцтэй РНХ -ийн загваруудын хувьд хоёрдогч бүтцийг бага температурт эсвэл нийтлэг урвуу транскриптазаар нээхэд хэцүү байдаг. Эдгээр загваруудын хувьд Quant Reverse Transcriptase-ийг сонгож болно, учир нь түүний урвуу транскрипцийн гүйцэтгэл нь M-MLV серийн урвуу транскриптазаас илүү сайн байдаг бөгөөд энэ нь янз бүрийн РНХ загваруудыг үр дүнтэйгээр эргүүлж, РНХ-ийг cDNA-ийн эхний хэлхээнд хамгийн дээд хэмжээнд нь хөрвүүлж чаддаг. Урвуу транскриптазын ерөнхий хэрэгслийг ашиглахдаа 20 мкл систем нь 1 мкг нийт РНХ -ийг үр дүнтэй буцааж бичих боломжтой. Багцын хамгийн их RT хүчин чадалд анхаарлаа хандуулаарай. Хэрэв загварыг хэтрүүлэн оруулсан бол урвуу транскрипц нь РНХ -ийг их хэмжээгээр ашиглах болно. Тиймээс системийн хамгийн дээд хүчин чадлаас хэтрэхгүй байх нь дээр.

А-1 РНХ-ийн ноцтой доройтол, RT амжилттай болсон эсэхийг тодорхойлох

Ерөнхийдөө дотоод лавлагааны олшруулалт амжилтгүй болох шалтгаан нь ихэвчлэн РНХ -ийн ноцтой доройтлоос үүдэлтэй байдаг. Өөр нэг боломжит шалтгаан бол урвуу транскрипцийн алдаа юм. Дотоод лавлагаа нь cDNA дан хэлхээний чанарыг үнэлэх стандарт болгон ашиглаж болохгүй, гэхдээ хэрэв РНХ -ийн чанарт ямар ч асуудал байхгүй бол урвуу транскрипц амжилттай эсэхийг шүүх стандарт болгон ашиглаж болно. Урвуу транскрипцийн процессын хамгийн чухал зүйл бол урвалын үр ашгийг дээшлүүлэхийн тулд тогтмол температур, тогтмол урвалын системийг хадгалах явдал юм.

А-2 Дотоод лавлах генийг олшруулах праймер найдвартай эсэх, ПГУ-д хэрэглэдэг урвалжуудтай холбоотой асуудал байгаа эсэхийг тодорхойлох.

Харьцангуй тоон үзүүлэлт хийхийн тулд урвуу транскрипц хийхээс өмнө РНХ -ийг тоон үзүүлэлтээр үнэлэх шаардлагатай бөгөөд энэ нь урвуу транскрипцийн олон хэрэгсэлд шаардлагатай байдаг, жишээлбэл, РНХ -ийн оролтыг 1 мкг гэж тооцдог. Урвуу хуулбарласан cDNA нь РНХ, олиго dT, фермент, dNTP, тэр ч байтугай ДНХ -ийн үлдэгдэл зэрэг холимог уусмал тул хазайлт үүсэх тул cDNA -ийг нарийн тодорхойлох боломжгүй юм. Тиймээс РНХ -ийн хэмжээг тодорхойлох шаардлагатай байна. Урвуу транскрипцийн үр ашиг нь өөр өөр дээжинд ижил байдаг тул олж авсан cDNA -ийн хэмжээ ижил байх ёстой бөгөөд тоон шинжилгээ нь ижил хэмжээний нийт РНХ -тэй өөр өөр генийн экспресс түвшний харьцуулалтыг харуулж чадна. Харьцангуй флюресцент тоон ПГУ -ыг гүйцэтгэх үед урвуу транскрипцийн дараа тоон cDNA шаардлагагүй байж болно, учир нь дотоод лавлах генийг лавлагаа болгон гүйцэтгэх боломжтой.

Энэ нь голчлон гентэй холбоотой бөгөөд урт фрагментийг урвуу транскрипц хийх нь ихэнх генийн хувьд боломжгүй юм. Нэгдүгээрт, урвуу транскрипцийн үр ашиг нь ПГУ -ынхаас хамаагүй доогуур байна. Хоёрдугаарт, GC -ийн баялаг бүс нутаг, олон генийн хоёрдогч бүтэц нь урвуу транскрипц ба ПГУ -ыг хоёуланг нь хязгаарладаг. Эцэст нь ПГУ -ын үнэнч байдал, олшруулалтын үр ашгийг нэгэн зэрэг баталгаажуулах нь хэцүү байдаг. Урвуу транскрипц хийх явцад бага хуулбарлагддаг генийн урт хэсгийг, ялангуяа oligo dT -ийг ашиглах баталгааг хэн ч өгч чадахгүй. Илүү их GC бүхий 5 'UTR -ийн хувьд бүр ч хэцүү байдаг. Тиймээс, санамсаргүй праймераар сийрүүлгийг буцааж, зорилтот хэсэг дэх байгалийн хагарлын цэгүүдийг олж, сегментүүдээр олшруулж, дараа нь хязгаарлалтын боловсруулалт, холболтыг хийх нь боломжийн арга хэвээр байна. Ерөнхийдөө 2 кб -аас дээш хэмжээтэй фрагментийг шууд олшруулах нь хэцүү байдаг, гэхдээ үүнийг авах нь үргэлж боломжгүй байдаггүй: 1. Юуны өмнө РНХ/мРНХ -ийн бүрэн бүтэн байдлыг баталгаажуулж, TRIZOL -ийг гаргаж авахыг илүүд үздэг. 2. M-MLV RT-ПГУ-ын иж бүрдлийг шууд ашиглаж болно. Нэвтрүүлэх хугацааг уртасгаж, олшруулах процессын мөчлөгийн тоог зохих ёсоор нэмэгдүүлэх. Эсвэл үүрлэсэн ПГУ -ыг хэрэглэж болно, эсвэл нэг эсвэл хоёр урвалыг зохих ёсоор уртасгасан денатураци хийж, ПГУ -ын хэвийн олшруулалтаас өмнө сунгах хугацааг хийж болох бөгөөд энэ нь фрагментийг сунгахад тусална. Полимеразын үнэн зөв байдалд анхаарлаа хандуулаарай. 3. Хамгийн тохиромжтой үр дүнд хүрэхийн тулд Long Taq -ийг ПГУ -д ашиглаж болно. 4. Уураг илэрхийлэхэд өндөр нарийвчлалтай полимеразыг хэрэглэнэ.

TIANGEN-ийн санал болгодог хоёр төрлийн урвуу транскриптаз байдаг: Quant/King RTase ба TIANScript M-MLV. Тэдний гол ялгаа нь загваруудын оролтын хэмжээ юм. Квант бол өвөрмөц урвуу транскриптаз бөгөөд Moloney murine leukemia вирусээс гаралтай түгээмэл хэрэглэгддэг M-MLV-ээс ялгаатай юм. Quant бол өндөр үр ашигтай урвуу транскриптаза юм. Quant нь 50 нг-2 мкг РНХ-ийг урвуу транскрипцийн идэвхжил өндөртэй, өндөр ургацтай болгоход тохиромжтой. Энгийн MMLV эсвэл AMV -тэй харьцуулахад Quant -ийн хамгийн том шинж чанар нь РНХ -ийн загвартай маш нягт уялдаатай бөгөөд өндөр температурт денатураци хийхгүйгээр транскрипцийн нарийн төвөгтэй загваруудыг буцаах боломжтой юм. GC -ийн агуулга өндөртэй загваруудын хувьд урвуу үр ашиг өндөр байдаг. Гэсэн хэдий ч энэхүү урвуу транскриптаз нь RNase H идэвхжилтэй бөгөөд энэ нь cDNA бүтээгдэхүүний уртанд нөлөөлж болзошгүй (<4.5 кб загварт тохиромжтой). Уламжлалт урвуу транскрипцийн хувьд TIANScript MMLV урвуу транскриптазыг ашиглахыг зөвлөж байна. Энэхүү RTase нь маш сул RNase H идэвхжилтэй, өөрчилсөн фермент бөгөөд урт (> 5 kb) cDNA синтез хийхэд тохиромжтой.

Нэг алхам урвуу транскрипц ба ПГУ-ын олшруулалтыг cDNA синтез ба олшруулалтын хооронд хоолойн тагийг нээхгүйгээр нэг хоолойд хийж гүйцэтгэдэг бөгөөд энэ нь бохирдлыг бууруулахад тусалдаг. Олсон бүх cDNA дээжийг олшруулахад ашигладаг тул мэдрэмтгий чанар өндөр бөгөөд хамгийн багадаа 0.01 pg нийт РНХ байдаг. Нэг алхамтай RTPCR амжилттай болохын тулд генийн өвөрмөц праймерыг ихэвчлэн cDNA синтезийг эхлүүлэхэд ашигладаг. Урвуу транскрипц ба ПГУ-ын олшруулалт гэсэн хоёр үе шаттай аргыг хоёр үе шаттайгаар явуулдаг. Нэгдүгээрт, cDNA -ийг олж авахын тулд урвуу транскрипцийг РНХ загвараар гүйцэтгэдэг бөгөөд олж авсан cDNA нь нэг буюу хэд хэдэн ПГУ -ын урвалд ордог. Хоёр үе шаттай арга нь олиго (dT) эсвэл санамсаргүй праймерыг ашиглан cDNA-ийн эхний хэлхээний нийлэгжилтийг удирдан чиглүүлэх боломжтой бөгөөд тодорхой дээжээс авсан бүх рНХ-ийн мэдээллийг буцааж хуулбарлах боломжтой.